----血液样本收集和循环DNA提取及循环DNA的检测分析方法

血液样本收集和循环DNA提取

    5 ml EDTA抗凝血

    4°C2500 rpm离心10 min，去除细胞

    80°C储存，备用

    用DNA试剂盒提取DNA（如QIAGEN、Puregene的血液游离核酸提取试剂盒）

循环DNA的检测分析方法

循环DNA的检测分析方法大体分为2类:低通量检测方法和高通量检测方法。低通量检测方法包括SYBER green法、实时PCR法和基于实时PCR所发展起来的一系列技术等，可以检测总的循环DNA的浓度以及ctDNA中的关键的突变（如EGFR的19号和21号外显子），微卫星不稳定性和甲基化位点等。总体上低通量检测方法所获信息局限。要想获得癌症基因组的全貌，需要应用高通量检测方法分析ctDNA。

循环DNA的检测分析方法也可分为定量和定性分析2类：定性分析主要检测血清或血浆中肿瘤特异性基因改变，包括基因突变、抑癌基因启动子高甲基化、MSI（微卫星不稳定）等；定量分析以检测血液循环DNA总量为指标。上述两种方法均可反映肿瘤的存在和严重程度。

1.循环DNA的检测分析方法（低通量的总的循环DNA定量方法）：实时PCR法

例子：通过定量血清中hTERT（human telomerase reverse transcriptase，端粒酶逆转录酶）基因的拷贝数间接定量总的循环DNA。总的循环DNA水平可用于区分癌症患者和正常个体。用以区分肺癌和正常人的循环DNA界值定为20 ng/ml，特异性达到83%，敏感性达到79%。也可用于预后判定，循环DNA浓度越高，个体生存期越短。

2.ctDNA的检测分析方法：数字聚合酶链式反应技术（低通量突变检测方法）

例子：用数字聚合酶链式反应技术法检测K-ras突变（胰腺癌），K-ras突变在组织的中检出率是74.7%，在ctDNA中的检出率是62.6%，二者的一致率为77.3%。